疫苗佐剂
播报上传视频
疫苗佐剂
疫苗佐剂(Adjuvant)是能够非特异性地改变或增强机体对抗原的特异性免疫应答、发挥辅助作用的一类物质。佐剂能够诱发机体产生长期、高效的特异性免疫反应，提高机体保护能力，同时又能减少免疫物质的用量，降低疫苗的生产成本。长期以来，传统疫苗(多为菌体或其裂解物)由于其免疫原性强，佐剂的研究和使用只局限于较小的范围，如毒素和类毒素。从巴斯德至今近百年来已开发了许多菌苗和疫苗，但传统的菌疫苗一般多为全细菌或全病毒制成，其中含有大量非免疫原性物质，这些物质除具有毒副作用外也具有佐剂作用。所以一般不需要外加佐剂，因此在这段时间里免疫佐剂并未引起人们广泛的注意。直到1925年，法国免疫学家兼兽医学家GastonRamon发现在疫苗中加入某些与之无关的物质可以特异地增强机体对白喉和破伤风毒素的抵抗反应 [1]，从此许多国家都不同程度的开展了这方面的研究。随着现代生物技术和基因工程技术的迅速发展，针对不同疾病已开展了各种新型基因工程疫苗的研制，但这些疫苗普遍存在分子小、免疫原性弱、难以诱导机体产生有效免疫应答等不足，从而需要某种物质来增强其免疫作用，免疫佐剂尤其是新型免疫佐剂的研究就显得尤为迫切。近年来，为适应新型疫苗的需求，佐剂已经从传统、单一的形式向新型、多元化形式发展，尤其用于黏膜疫苗、DNA疫苗及肿瘤疫苗的佐剂研究成为热点。
- 中文名
- 疫苗佐剂
- 外文名
- Vaccine adjuvant
- 包 括
- 抗独特型抗体疫苗,核酸疫苗
- 特 点
- 纯度高,相对分子量小
佐剂(Adjuvant)又称免疫调节剂或免疫增强剂(Immunepotentiator)，起源于拉丁文“Adjuvare”，是辅助或者增强的意思。佐剂是疫苗的一种添加剂，当它先于抗原或与抗原混合注入机体后，能够增强机体对抗原的免疫应答或者改变免疫反应的类型，属于非特异性的免疫增强剂，而其本身无抗原性。理想的佐剂不仅能够增强免疫反应，而且能使机体获得最佳的保护性免疫 [2]。
随着科研工作者不断深入的对免疫佐剂进行研究，新型免疫佐剂不断被发现，常见的免疫佐剂大致可以分为以下几类 [3]。
1926 年，铝佐剂的佐剂活性被证实，广泛使用至今，已有 90 多年。铝佐剂是一种乳白色的冻胶状半固体，目前常见的铝佐剂有氢氧化铝凝胶、磷酸铝、硫酸铝、铵明矾及钾明矾等，但常用的是 Al( OH) 佐剂。 Al( OH) 3 的应用非常广泛，是目前唯一被国际开发协会( IDA) 批准的可应用于人类和兽类的免疫佐剂。该佐剂具有抗原吸附的作用，能够从溶液中将蛋白质抗原吸附，最终形成抗原沉淀。当将其注射到机体内后就可以缓慢将抗原释放出，从而大大延长了抗原作用的时间，同时还能促进注射部位巨噬细胞的应答。
但铝佐剂也存在其不足之处，与其他应用的佐剂相比较产生较弱的免疫应答，且不能参与细胞免疫应答; 有研究揭示铝佐剂在白鼠体内可进入大脑，存在风险。诱导产生的免疫反应类型有偏向性( Th2 型) 、局部反应重等。
1936 年，油乳佐剂被成功开发，弗氏完全佐剂研发问世。油乳佐剂最主要的成分是油料。根据所用油料的区别可将油乳佐剂分成矿物油佐剂和非矿物油佐剂两种。这类免疫佐剂可以促进多种抗原产生高效价的抗体，使抗原连续刺激的时间相对延长，抗原接种的剂量减少，抗原接种的次数降低，因为这些优点，油乳佐剂在动物疫苗中得到了广泛的应用。但是这种佐剂在生物机体内起作用的同时也会伴随着一些安全隐患，如造成组织损伤、应激反应、矿物油的残留，以及可能致癌等。
油乳的主要作用机制可以解释为: ( 1) 特异性抗原被油包裹，从而可以缓慢释放，并且被油包裹住的抗原还可以避免被酶解，进而可以不间断的使机体产生高效的特异性免疫应答; ( 2) 油可以刺激机体局部产生炎症反应，有助于刺激免疫细胞使其增殖，从而提高机体的免疫应答水平。
目前市场上常见的油乳佐剂主要有弗氏佐剂、白油 Span 佐剂、MF-59、ISA 206、ISA 720、佐剂-65、SAF 等，其中兽用疫苗多用油包水型佐剂，人用疫苗多用水包油佐剂。油佐剂在与疫苗配合使用时都要经过乳化这一过程，常见的乳化设备有立体胶体磨、高压匀浆泵、罐内剪切机及乳化罐等。不同的油佐剂有不同的乳化工艺。以ISA 206 乳化工艺为例，佐剂与抗原配比为质量比 1∶ 1，滴加时将油相和水相温度调整合适，抗原滴加速度为160 万 ml / h，滴加时搅拌速度为 80r / min。乳化过程中均质压力调整合适的低压、高压。一般均质后温度为29℃ ，分装前降温至 15℃ 。
微生物作为佐剂能够增强机体免疫应答很早之前就有报道。20 世纪 50 年代，革兰氏阴性菌的脂多糖被证实具有免疫佐剂的功效。随着对微生物类佐剂研究的不断深入，越来越多的微生物被证实具有佐剂功效， 目前已被发现具有佐剂功效的微生物类佐剂大致有: 分枝杆菌及某些百日咳杆菌、绿脓杆菌、布氏杆菌、大肠杆菌、魏氏梭菌的脂多糖及结核杆菌素等; 革兰氏阳性菌有葡萄球菌、短小棒状杆菌、链球菌、乳杆菌等。实验表明，当这些微生物或其产物与免疫疫苗同时注入时，具有明显增强机体特异性免疫应答的功效。但是细菌成分一般都具有毒性，所以这也是微生物类佐剂难以成为人用疫苗佐剂的重要原因之一。
20 世纪 60 年代，苏联科学家对蜂胶的佐剂活性进行了研究，证实了蜂胶具备免疫佐剂活性。蜂胶是蜜蜂首先在植物芽孢或树干上采集树脂，然后将采集好的树脂经过一系列的处理后所形成的一类具有芳香气味的胶状固体物。蜂胶的成分极其复杂，代表性的成分有黄酮类化合物、多种氨基酸、芳香挥发油、维生素及多种微量元素等。蜂胶其本身并不会加强机体的免疫应答，然而当其与疫苗同时使用时就可以发挥佐剂的功效，增强机体的免疫应答，是一类天然的免疫增效剂，而且其还具备抑菌的功效。与传统佐剂相比，如油乳佐剂，蜂胶佐剂具有更高的安全性。
1971 年，Ｒenoux 等发现左旋咪唑与免疫疫苗配合使用可以增强免疫效果。自此，人们开始了对左旋咪唑佐剂活性的研究。左旋咪唑是经消旋四咪唑和 d-樟脑-10-磺酸环合后经过将其水解成盐而得到的咪唑衍生物。在兽医临床上被广泛应用于抗虫，主要的作用对象是蛔虫和钩虫。研究表明，左旋咪唑有免疫佐剂的功效，可以配合免疫疫苗使用从而提高机体的免疫应答效力。其可以诱导 T 细胞分化，使 T 细胞转化成致敏的 T 细胞，接而产生 MHF 和 MIF 等淋巴因子，最终进一步活化巨噬细胞。当外周免疫细胞、T 细胞、巨噬细胞和中性细胞的功能受到损伤时，左旋咪唑可恢复受损功能。左旋咪唑一般副作用比较小，但是长期使用会引起腹泻及肝损伤等。
1974 年，Allison 等首次报道脂质体具有免疫增强剂的功效。脂质体经卵磷脂和神经酰胺等制得，特点是具有双分子层结构，研究表明，磷脂的酰基链越长、饱和度越高，其增强机体的免疫应答效果越明显。它作为佐剂的同时还具备载体的功能，与细胞膜的微球体相类似。
脂质体作为佐剂具备许多优点: ( 1) 脂质体的安全性非常高，因为它是由一类类细胞膜材料构成的，所以脂质体完全可以被生物降解，没有残留。( 2) 磷脂的结构同时包含亲水性基团与亲脂性基团，无论是亲水性抗原还是亲脂性抗原都可以被其包封，所以脂质体具有广泛的应用性。( 3) 被脂质体包封的抗原可以避免被降解，从而可以缓慢连续释放抗原，持续刺激机体产生特异性免疫应答。( 4) 脂质体可以冻干保存。
虽然脂质体具有如此多的优点，其缺点也不容忽视，主要表现在以下两个方面: ( 1) 虽然脂质体安全性很高，但它也存在部分轻微的副作用; ( 2 ) 脂质体对抗原的包封率不是很均一，其对有些抗原的包封结果不理想，所以就很难发挥疫苗的免疫作用。
1984 年，QuilA 被报道具有免疫增强剂的效果。QuilA 是从南美皂树的树皮中提取的一类皂苷。但是其具有很强的副作用，具有很强的毒性，不仅能引起肉芽肿，还会引起溶血现象。随着研究的深入，越来越多的中药成分被应用于疫苗中充当佐剂，常见的用作佐剂的中药成分有皂苷类、中药中的多糖成分和中药复方。( 1) 皂苷是一种甾体或三萜配糖类物质，它广泛地存在于陆地高等植物中，也有为数不多的存在于低等海洋动物与一些细菌之中。许多皂苷类成分可以充当佐剂，有些皂苷还有抑菌作用，且安全性较高。( 2) 中药多糖成分同样可以充作良好的佐剂，多糖是至少 10 个单糖经过糖苷键连接形成的糖链，常见的含有多糖成分的中药材有天麻、甘草、黄芪、冬虫夏草和灵芝等。这类多糖成分的副作用极低，无细胞毒性，不会抑制骨髓造血细胞的繁殖，也不会使机体抗感染能力下降。( 3 ) 中药复方也有充当佐剂的潜力，有实验表明玉屏风散、四君子汤、金鸡散、黄连解毒汤等复方中药与免疫疫苗同时使用时，明显提升了动物血清中的抗体效价，这表明中药复方可以增强机体免疫效果，作为疫苗佐剂有一定的发展潜力。
小肽类佐剂是近几年来发现的可以增强免疫效力、具备佐剂功效的一类物质。它是由菌分泌在上清中，通过截留可以获得的小于 10kDa 的肽段。通过动物免疫实验发现，小肽明显提升了机体产生抗体的效价，具备佐剂功效。小肽作为佐剂具备很多优势: 获取简单; 便于储存与运输; 因为是益生菌所分泌，所以对机体无害，安全性高，有望作为人用疫苗佐剂。
这些佐剂根据其作用机制，可以归纳为以下类型 [3]。
抗原存储库效应
在机体局部注射抗原后，佐剂将过多的抗原募集并储存，并缓慢连续释放，通过这种方式使抗原连续刺激时间延长，从而提高抗体效价，提高机体免疫应答效果，如脂质体佐剂等。
使细胞因子和趋化因子表达上调，于注射位点募集免疫细胞
细胞因子是指由机体细胞经刺激而合成、分泌的一类小分子蛋白质。它具有广泛生物活性，很低的水平就可以表现出生物学活性，是细胞间信号传递分子， 其通过结合相应的受体调控免疫应答。趋化因子是指能够将白细胞迁移到感染部位的一些低分子量(多为8 ～ 10kDa) 的蛋白质( 如 IL-8、MCP-1 等)。在免疫应答中，细胞因子和趋化因子扮演着重要的角色，上调细胞因子和趋化因子表达能够使机体的免疫效应增强，如微生物类佐剂、MF59 等。
增加抗原的表面积
一些抗原体积小、相对分子质量低，不足以诱导免疫应答，佐剂通过将其包裹，增加了抗原的分子量及表面积，从而增强了抗原的免疫原性，如油乳佐剂等。
载体作用
一些佐剂可以起载体的作用，将抗原包裹，避免抗原被酶降解，从而可以连续释放抗原，增加抗体效价，如铝佐剂等。
促进树突状细胞的活化与成熟，使抗原提呈增强
树突状细胞( dendritic cell，DC) 是机体功能最强的专职抗原提呈细胞( antigen presenting cell，APC) ，它可以有效地摄取、加工处理和提呈抗原。某些佐剂可以促使树突状细胞活化成熟，从而使抗原提呈加强，增强机体的免疫应答，如油乳佐剂等。
激活炎性小体
炎性小体( inflammasome) ，又称炎症小体，是由多种蛋白质组成的复合体，是天然免疫系统的重要组成部分，分子量约为 700kDa。炎性小体能够调节胱冬肽酶-1( caspase-1) 的活化进而在天然免疫防御的过程中促进细胞因子前体 pro-IL-1β 和 pro-IL-18 的切割成熟［46］。炎性小体还能调节 caspase-1 依赖的形式编程性细胞死亡，诱导细胞在炎性和应激的病理条件下死亡，如铝佐剂等。
疫苗佐剂种类繁多，效果也是明显的，但它们也有一些不可避免的缺点 [2]：
佐剂的安全性是一个十分重要的问题，但又是一个容易被忽视的问题，研究表明，绝对安全的佐剂是不存在的。人们只能根据佐剂的作用机制进行调整，尽可能做到免疫刺激作用最大化，而毒副作用最低化。临床观察设计时，要充分考虑佐剂、佐剂与疫苗使用引起的不良反应的收集。如果是新佐剂与已上市抗原的临床研究，应有与已上市疫苗(佐剂和抗原)不良反应的比较和分析。如果是新佐剂与新抗原，则应按照国家有关要求，系统而详细地收集不良反应，包括局部和全身反应、有关系统的实验室检测指标和仪器检查结果等。
一些佐剂可诱导强烈的抗体应答和细胞免疫，但仍有个别试验者接种后出现较强的局部副反应，反应出现频率具有抗原或剂量依赖性。疫苗佐剂的质量控制是直接关系其临床试验安全性的关键因素。如在1945～1960年疫苗研究中广泛应用的FIA，因其某批次出现质量问题导致脓肿发生大量增加而最终于1960年后期被终止使用。尽管该佐剂具有较强的佐剂效应，但其不安全因素限制了进一步发展，这种不安全因素主要与其使用剂量以及组份中矿物油化学链长度相关。
除了上述两个主要问题外，佐剂还存在一些问题：如油佐剂较粘稠不利于注射、乳化不好容易分层、同时在注射局部反应较严重；氢氧化铝佐剂难以诱导弱抗原的免疫反应且不能诱导细胞免疫；脂多糖佐剂存在较强的毒副作用、脂质体的稳定性有待提高，氧化甘露聚糖与抗原结合方式局限、蜂胶佐剂注射部位形成肿块等问题。某些佐剂作用机制的认识仍不够深入，使得新型佐剂的进一步发展困难重重。另外一些佐剂由于制备过程复杂，价格昂贵也限制了它们的推广应用。
人用疫苗佐剂的研究,其最终目的是与疫苗一起应用于人体,进行传染病的预防。而疫苗佐剂临床观察的评价结果决定着该佐剂能否应用于临床。疫苗佐剂在临床前和临床研究中,主要应考虑以下几个方面 [4]。
1.佐剂对疫苗免疫原性的影响
首先,必须证明佐剂确实能够有效诱发机体产生长期、高效的特异性免疫反应,提高机体保护能力,这是佐剂应用的基础。如果研究结果显示加入佐剂对免疫原性的增强效果甚微,则不应加入,以避免佐剂带来的其他副反应。免疫效果应包括体液免疫和细胞免疫两个方面。体液免疫除检测功能性抗体(中和、调理吞噬或杀菌抗体)外,还应检测免疫球蛋白的亚类。细胞免疫应检测抗原特异性T细胞反应,包括Th1、Th2和T细胞调节因子和（或）有关的细胞因子等。
2.佐剂的毒理学及药理学
佐剂的毒理学方面,主要考虑接种部位的病理反应、机体产生的抗体反应、抗体持续时间等。目前我国批准用于疫苗的佐剂为氢氧化铝,而铝佐剂通常使疫苗产生抗体的时间滞后,且增加注射局部的副反应发生率。如疫苗的抗原量能满足免疫的需要,则建议不加佐剂。佐剂的药理学试验主要应考虑发生作用的原理、作用结果与剂量的关系、免疫程序和接种途径与效果的关系等。
3.佐剂与疫苗中各成分的相互作用
佐剂作为疫苗成分中的一部分,应该与其他成分相容,如佐剂与防腐剂、佐剂与非活性成分等。并应考虑佐剂对不同成分吸附作用的影响,吸附后是否有解离及解离程度、各组分的添加顺序对吸附产生的影响等。
4.佐剂单独给药时人体内的代谢
新疫苗佐剂,包括已上市的佐剂,改变用量或给药途径,需要充分的临床前安全性数据的支持。同时考虑佐剂可能会在体内蓄积,还应进行佐剂单独给药时的人体药代动力学研究。人体药代动力学研究的设计应依据临床前研究资料,根据佐剂的性质和特点进行,以获得科学的、令人信服的结果。
5.佐剂的剂量
佐剂的使用剂量以及佐剂与抗原的比例,关系到是否能够诱导出所需的免疫应答反应和尽量减少不良反应。对于新佐剂和已上市的抗原结合物的剂量范围,应参照已上市同类产品的用量。对于新佐剂和新抗原的结合物,既要研究佐剂的用量,也要注意选择佐剂与新抗原的最佳比例。应尽可能在疫苗的目标人群中进行研究,并设计多个剂量组。
6.免疫增强效果
临床观察应遵循GCP原则,设计时不仅应随机、双盲、设置对照,而且还应结合抗原和佐剂的特性。应在目标人群中进行观察,如果年龄组的跨度较大,在设计中应事先进行分层或进行一个以上的临床观察。对于大多数临床观察,尤其是如果已获得上市许可的疫苗抗原量发生了变化,则需要重点评价与保护有关的有效性免疫指标。如果没有,就要对其免疫保护效果进行评价。对于新佐剂新抗原疫苗,还要采用预防同样疾病的上市疫苗作为对照。如果没有,也可采用目标人群可用的、其他不相关的疫苗作为安慰剂对照。必要时,还应设立多组对照。样本量应满足统计学要求。对非劣效试验,必须事先设定非劣效的界值,并提供设定的依据。在设计临床观察使用的分析方法和样本量大小时,还应适当考虑多因素影响的问题。
7.局部和全身反应
研究表明,绝对安全的佐剂是不存在的。人们只能根据佐剂的作用机制进行调整,尽可能做到免疫刺激作用最大化,而毒副作用最低化。临床观察设计时,要充分考虑佐剂、佐剂与疫苗使用引起的不良反应的收集。如果是新佐剂与已上市抗原的临床研究,应有与已上市疫苗(佐剂和抗原)不良反应的比较、分析。如果是新佐剂与新抗原,则应按照国家有关要求,系统而详细地收集不良反应,包括局部和全身反应、有关系统的实验室检测指标和仪器检查结果等。
长期以来，佐剂研究被认为是疫苗行业的“dirtvlittle secrets”，这主要是人们对佐剂的作用机制了解较少。从设计理念来看，早期的疫苗佐剂铝盐和乳剂，其机制主要在于延缓抗原清除、缓释免疫原和提高抗原被摄取的数量。近年来，现代免疫学的发展尤其是对于固有免疫知识的积累，在一定程度上加速了疫苗佐剂的开发。这些免疫佐剂多靶向于模式识别受体。模式识别受体是免疫细胞表达的，与病原微生物或细胞应急相关的蛋白。典型的模式识别受体可以分为五类，包括Toll样受体(TLRs)，RIG-I样受体(RLRs)，NOD样受体(NLRs)C型凝集素受体(CLRs)和DNA感受器(如STING等)。以新型佐剂为代表的疫苗突破了传统以铝佐剂为主诱导Th2免疫反应类型、应答慢、持久性差等的瓶颈。
达到既可以诱导高水平持久性抗体，又能诱导极强的Th1型免疫反应的理想目标。其代表有CpG佐剂的乙肝疫苗、QS21+MPL的水痘带状疱疹病毒疫苗我国在基干模式识别受体的佐剂研究方面也有很多亮点工作，例如北大的蒋争凡教授发现锰离子有很好的STING激活作用，其开发的以纳米胶体形式存在的二价锰有优秀的疫苗佐剂效果。从细胞层面上，这些疫苗佐剂通过激活模式识别受体而活化了抗原呈递细胞(主要是树突状细胞)，将抗原的信号有效地传递给效应T细胞，从而起到调节抗原相关免疫应答的作用。整体上新型佐剂研究都是基于模式识别受体或所谓的炎症效应到共刺激分子的方法学。
佐剂设计需要跳出已有思维局限，发掘新方向。可以预见除了代谢通路外，激酶等其他药物靶点也可以被用来开发小分子佐剂，活化天然免疫。
佐剂作用原理的核心在于促讲病原体的多肽抗原被获得性免疫识别，产生特定的抗体和细胞应答。因此，任何能促进这一过程的因素都有可能被利用干发展新型的佐剂分子。例如，完整的免疫应答需要经过抗原递呈细胞，T细胞以及B细胞进行，未来可以设计针对这其中的多个环节，包括抑制免疫反应的负反馈，如靶向PD1、PDL1以及CTLA4等免疫检查点、抗原递呈细胞以及T细胞的凋亡：T细胞衰竭，Trea以及MDSC等抑制性细胞等诸多方面:另一方面也可以发展直接针对T细胞以及B细胞的免疫刺激剂。同时，艾滋病、寄生虫等疫苗的成功往往需要诱导特定的细胞应答。例如，yO-T细胞在疟原虫疫苗诱导的免疫保护中起著重要作用，而目前的小分子佐剂都不能诱导vδ-T细胞活化。无疑，未来的疫苗佐剂需要向多样化、精细化的方向发展，这些对药学研究提出了更高的要求，需要针对免疫的精细调节发展安全、有效的小分子化合物 [5]。
