生物素与链霉亲和素如何洗脱？

链霉亲和素（Streptavidin，简称SA）是与亲和素有相似生物学特性的一种蛋白质，可抵抗蛋白酶消化、极端pH和温度。生物素-链霉亲和素复合物是最常见的标志物之一，用于结合生物分子，如蛋白质、脂质和核酸，以及合成分子，如荧光标记。在样本制备领域，作为许多纯化系统的核心部分，同时在WB、IHC、ISH、流式细胞术、化学发光领域发挥着巨大的作用。

链霉亲和素，分子量约为65kDa，等电点6.0，是从链霉菌Streptomyces Avidinii培养物中提取的一种分泌性蛋白质。链霉亲和素是四聚体蛋白，一分子链霉亲和素可以高度特异性地与四分子生物素结合。链霉亲和素-生物素复合物的解离常数处于10mol/L数量级，是一种非常完美的生物素结合蛋白，其适用范围也比亲和素更为广泛，这一特点也被常用在生物学上。

应用领域

链霉亲和素具有与生物素特异结合的能力，并能与辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光基团等结合，且等电点比亲和素低，因而参与免疫学中的检测信号放大，广泛应用于化学发光、IHC、WB、IF、ISH、流式、核酸提取、蛋白纯化等实验及亲和色谱填料的制备、生物传感器、生物芯片的制作。

链霉亲和素衍生物

及其应用举例

根据链霉亲和素不同的偶联物，可以大致将其分为三个大类：酶偶联标记的链霉亲和素、荧光基团标记的链霉亲和素、固化链霉亲和素。

表1.常见链霉亲和素衍生物分类及其应用

酶偶联的链霉亲和素主要的偶联物是辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。比较而言，前者更经济、快速、稳定，而后者较前者更为灵敏。通常情况下，碱性磷酸酶（AP）更适合于固相的免疫检测实验，如ELISA和WB。ELISA既可测定抗原也可测定抗体，生物素－链霉亲和素系统在ELISA中的应用有多种形式。其主要的应用包括：

包被材料：在固相上先预包被链霉亲和素，通过链霉亲和素－生物素反应而使生物素化的抗体或抗原间接包被。

放大信号：链霉亲和素对生物素化的抗体是一个主动的吸附过程，生物素化的抗体吸附在链霉亲和素表面，且1分子链霉亲和素可以结合4分子的生物素，此过程可以放大信号。

常见标记链霉亲和素的荧光基团有：FITC、TRITC、花青染料（Cy2、Cy3、Cy5）、Alexa Fluor系列、Dylight系列等。FITC是广泛使用的荧光基团，但其最大的缺点是淬灭快，使用抗淬灭剂可以减缓淬灭速度，TRITC经常和FITC一起用于双标记实验中。DyLight荧光染料是一类具有较高亮度的新型染料，具有很好的光谱宽度、更强的荧光强度，更高的光学耐受性（抗淬灭性）、对pH不敏感、分子较小而渗透性更好的优势。由于观察荧光需要一定波长的激发光，必须根据实验室已有的仪器可发光的波段进行选择。

表2.荧光染料对应表

链霉亲和素琼脂糖是基于链霉亲和素与生物素之间的相互作用，将链霉亲和素高度交联于6%琼脂糖上，独特的制备工艺使其具有更高的物理化学特性，可以耐受更高的压力，在相对较高的流速下，实现对目的蛋白的纯化，更适于工业大规模蛋白的纯化。

什么是过氧化物酶链霉亲和素 (Peroxidase Streptavidin, SA-HRP) ？

链霉亲和素（Streptavidin，简称SA）是从细菌阿维丁链霉菌中纯化出的一种60kDa的蛋白质。链霉亲和素同源四聚体对生物素（即维生素B7）具有极高的亲和力。而过氧化物酶链霉亲和素就是将过氧化物酶（Horseradish Peroxidase，缩写为HRP）偶联在链霉亲和素上形成，可与Biotin标记的各种亲和纯化抗体或者Biotin标记的色谱级蛋白联用进行各种免疫检测。

SA-HRP在免疫学基础实验中的应用：

1、Western blotting (ECL substrates)

2、Immunocytochemistry（石蜡切片，SP法）

3、ELISA（以双抗夹心法为例）

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