代谢重编程是巨噬细胞发挥功能的基础。在巨噬细胞代谢重编程的过程中，三羧酸循环（TCA）的异常能导致多种中间产物的积累，进而参与免疫调控过程。但其中，发挥主要作用的产物以及中间的具体机制有待进一步研究。
近年来，以代谢重编程为研究对象的高分文章不断涌现，且在国自然的资助项目中呈指数增长，可见代谢重编程已成为当前生命科学以及基础医学研究的一大热点。
近日，Nature上发表的最新研究中，研究者通过多组学分析筛选得到研究对象，进一步根据已发表相关实验结果来层层剖析，最终发现了影响巨噬细胞代谢重编程的主角以及机制。
此项研究在了解炎症性疾病发展过程中身体产生何种变化的研究中，取得了重要突；并发现了一个潜在的新治疗靶标。接下来，让梅斯小编带你一起探索这篇nature研究内容及思路。
一、研究内容与思路
1、富马酸盐在巨噬细胞中的积累
研究者采用无偏代谢组学方法，探究了LPS刺激下炎症性骨髓源性巨噬细胞（BMDM）的代谢改变，发现TCA循环代谢物富马酸显著升高。但急性LPS刺激对呼吸没有损害，不足以支撑富马酸盐的积累。而此前研究发现，LPS刺激下天冬氨酸-精氨基琥珀酸分流增加，而富马酸盐可由精氨基琥珀酸合酶（Ass1）裂解精氨基琥珀酸盐后得到。
基于此，研究者发现天冬氨酸（精氨基琥珀酸的前体）减少，而精氨基琥珀酸、富马酸和苹果酸水平增加。采用蛋白组学分析和P RT-qPCR检测，进一步表明精氨基琥珀酸合酶（Ass1）表达升高，富马酸水合酶（FH）表达下降，而其他酶没有变化。FH水平仅在LPS刺激较晚时间被抑制，表明了Ass1诱导对于富马酸累积是较为重要的。除此之外，在LPS刺激下，抑制天冬氨酸-精氨琥珀酸盐分流的GOT2抑制剂AOAA（氨氧乙酸）及精氨基琥珀酸裂解酶（ASL）敲除后对富马酸积累都存在影响，表明富马酸的产生依赖于天冬氨酸-精氨琥珀酸分流，增加细胞内富马酸水平。
研究思路：首先，研究者分析了巨噬细胞代谢过程中出现的改变，发现富马酸水平显著性升高（可能在这一环节发现了其他代谢产物的升高，但研究者基于表达量等多种因素选择了富马酸）。进一步发掘富马酸来源，最终发现富马酸的产生依赖于天冬氨酸-精氨琥珀酸分流。
2、抑制FH导致代谢重编程
抑制富马酸水合酶（FH）会增加细胞质富马酸盐的积累，扰乱尿素循环代谢。研究者采用FHIN1（FH抑制剂）、DMF（二甲基富马酸）和表达cre-ERT2的FH-/-小鼠模型来分析FH活性及富马酸盐在巨噬细胞中的作用。
结果显示，FHIN1降低了ATP/ADP、ATP/AMP和P-肌酸/肌酸的比率，而DMF不能，这表明FH维持线粒体生物能量。且FHIN1引发了一种独特的TCA循环代谢物代谢特征改变，包括柠檬酸盐、乌头酸盐、衣康酸盐和琥珀酸盐，表明FHIN1处理后TCA循环被重新编程并增加富马酸和2-琥珀酰代半胱氨酸（2SC）的累积，表明了FH在巨噬细胞中所发挥的作用。
FHIN1损害氧化呼吸，因此研究者检查了其他线粒体参数，发现在FHIN1处理条件下，活性氧物种增加、线粒体膜势能增加、乌头酸/柠檬酸比率下降、GSSH/GSH总体比率不变以及总谷胱甘肽耗尽，而在DMF条件下则未出现以上情况。这些结果表明，抑制FH能诱导大量的氧化还原应激反应。
研究思路：明确了巨噬细胞代谢重编程的主角「富马酸」后，研究者进一步探究了富马酸在巨噬细胞代谢过程中所发挥的作用，通过抑制FH表达或外源性增加富马酸来探究究竟是FH发挥作用还是富马酸发挥作用，结果证明FH发挥出较为显著的作用。
除此之外，代谢重编程是线粒体的主要功能，因此研究者还探究了FH对线粒体的影响，最终表明FH能诱导大量的氧化还原应激反应，从而调节代谢重编程。
3、FH可维持细胞因子反应
研究者采用RNA测序、蛋白质组学和基因富集分析等，进一步评估了FH是否具有调节巨噬细胞活化及效应作用，发现FHIN1降低IL-1和IL-10信号通路蛋白的表达，还观察到血红素调节抑制剂应激反应、氨基酸代谢和tRNA氨酰化成分表达增加，且TNF信号通路上调最显著。
研究者比较了FHIN1和DMF对于细胞因子的影响，发现两者均降低IL-10表达，促进TNF表达。进一步的转录组学分析发现，在FHIN1和DMF条件下，ERK1和ERK2级联和PI3K信号传导通路均显著下调，而前人发现LPS刺激后，IL-10受ERK1和ERK2以及PI3K诱导的AP-1激活的调节，表明FHIN1和DMF可能通过下调此信号轴发挥抑制IL-10表达作用。
进一步，研究者发现，在FHIN1和DMF条件下，c-Fos被破坏，无法形成AP-1（激活蛋白-1）复合物，推测富马酸可能通过对c-Fos烷基化影响了AP-1蛋白形成，从而抑制IL-10蛋白的表达和释放。这一过程可被硫醇前体N-乙酰半胱氨酸(NAC)消除，表明IL-10的抑制是由氧化还原依赖性琥珀酰化引起的。此外，研究者还验证了IL-10与TNF之间的联系，发现FHIN1或DMF通过促进TNF表达来抑制IL-10，从而调节巨噬细胞代谢。
研究思路：明确FH在代谢重编程中发挥的作用后，接下来便是分析FH在巨噬细胞中的作用机制，研究者采用了多组学分析来探究这一环节，发现FH对一些细胞因子存在着较为显著的调节作用。
进一步通过抑制FH或外源性增加富马酸来验证上述多组学所得结果，所得结果与多组学结果一致，表明FHIN1或DMF通过促进TNF表达来抑制IL-10。
4、FH抑制mtRNA驱动释放IFNβ
RNA测序结果表明，抑制FH对IFN表达和信号传导有不同影响，如上调IFNβ和几个干扰素刺激基因Irf1、Ifih1、Rsad2 和Ifit2。进一步发现，FHIN1增加了LPS刺激的巨噬细胞释放IFNβ，而DMF不能。结合上述实验发现，FH抑制会影响线粒体应激，而线粒体应激又与免疫调节型线粒体核酸的释放相关；除此之外，FH缺陷型遗传性平滑肌瘤病和肾细胞癌肿瘤表现出线粒体DNA(mtDNA)的变化。
基于此，研究者提出假设：IFN反应可能是由细胞质中核酸感受器驱动的。对此，采用溴化乙锭去除mtDNA之后，发现FHIN1不再促进LPS诱导的IFNβ释放，表明FHIN1促进IFNβ释放这一环节可能取决于mtDNA。此外，研究者还发现了FHIN1促进细胞质中mtDNA、mtRNA和dsRNA增加。先前的研究显示，线粒体单链RNA（ssRNA）参与驱动TLR7依赖的IFN信号。
因此，研究者分别沉默了TLR7或者双链RNA感受器Ddx58和Ifih1，发现FH抑制引起的IFNβ增加效果消失，表明FHIN1驱使的IFN响应需要这些感受器和mtRNA。同样的，在遗传学敲除的巨噬细胞以及体内实验中也得到了类似结果。
研究思路：研究者探究了FH抑制后促进IFNβ释放这一环节是如何开展的以及中间涉及了什么。根据FH抑制后会促进线粒体应激，线粒体应激又离不开核酸释放，而前人研究显示核酸水平改变与FH缺陷存在着联系，因此，研究者大胆猜测，这一环节会不会与线粒体DNA或者RNA水平相关，并开展了验证。
二、小结
上述研究中，研究者描述了在巨噬细胞中，由FH引发的线粒体膜超极化和mtRNA释放的现象，阐述了其涉及的线粒体信号通路，表明线粒体应激可能是IFN释放的机制，展现了慢性炎症疾病进展过程。
整体逻辑清晰、环环相扣！首先，研究者通过组学分析发现，FH在巨噬细胞代谢重编程中的作用。考虑到代谢重编程与线粒体息息相关，于是联系到线粒体。进一步，采用多组学分析其整个作用通路，并与基因水平相联系，为新抗炎疗法提供了潜在新治疗靶标及应用价值。
参考文献：
撰写：MIE