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- 中文名
- 中国药典无菌检查法
- 行 业
- 药业
- 类 别
- 办法
- 所在国家
- 中国
无菌检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行,其全过程应严格遵守无菌操作,防止微生物污染,防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。隔离系统应按相关的要求进行验证,其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。日常检验还需对试验环境进行监控。
注:《医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行版国家标准分为:
培养基的制备及培养条件
培养基可按以下处方制备,亦可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。制备好的培养基应保存在2℃~25℃、避光的环境,若保存于非密闭容器中,一般在三周内使用;若保存于密闭容器中,一般可在一年内使用。
1.硫乙醇酸盐流体培养基
无水葡萄糖 5.0g 氯化钠 2.5g
除葡萄糖和刃天青溶液外,取上述成分混合,微温溶解,调节pH 为弱碱性,煮沸,滤清,加入葡萄糖和刃天青溶液,摇匀,调节pH值使灭菌后为7.1±0.2。分装至适宜的容器中,其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层(粉红色)不超过培养基深度的1/2。灭菌。在供试品接种前,培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5 ,否则,须经100 ℃水浴加热至粉红色消失(不超过20分钟),迅速冷却,只限加热一次,并防止被污染。
硫乙醇酸盐流体培养基置30℃~35℃培养。
2.胰酪大豆胨液体培养基
葡萄糖/无水葡萄糖2.5g/2.3g 氧化钠 5.0g
磷酸氢二钾 2.5g 水 1000 ml
除葡萄糖外,取上述成分混合,微温溶解,滤过,调节pH值使灭菌后为7.3±0.2,加入葡萄糖分装,灭菌。
胰酪大豆胨液体培养基置20℃~25℃培养。
3.中和或灭活用培养基
胨 10.0g 氯化钠 5.0g
葡萄糖 5.0g 水 1000 ml
牛肉浸出粉 3.0g
除葡萄糖外取上述成分混合,微温溶解,调节pH为弱碱性,煮沸,加入葡萄糖溶解后,摇匀,滤清,调节pH值使灭菌后在25℃为7.2±0.2,分装,灭菌。
胰酪胨 15.0g 大豆木瓜蛋白酶水解物 5.0g
氧化钠 3.0g 琼脂 15.0g
水 1000 ml
除琼脂外,取上述成分混合,微温溶解,调节pH值使灭菌后在25℃为7.3±0.2,加入琼脂,加热溶化后,摇匀,分装,灭菌。
6.沙氏葡萄糖液体培养基
葡萄糖 20.0g 水 1000ml
除葡萄糖外,取上述成分,混合,微温溶解,调节pH值使灭菌后在25℃为5.6±0.2,加入葡萄糖,摇匀,分装,灭菌。
7.沙氏葡萄糖琼脂培养基
动物组织胃蛋白酶水解物和胰酪胨等量混合物 10.0g
葡萄糖 40.0g 琼脂 15.0g 水 1000ml
除葡萄糖、琼脂外,取上述成分,混合,微温溶解,调节pH值使灭菌后在25℃为5.6±0.2,加入琼脂,加热溶解,再加入葡萄糖,摇匀,分装,灭菌。
培养基的适用性检查
无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基等应符合培养基的无菌性检查及灵敏度检查的要求。本检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行。
无菌性检查 每批培养基随机取不少于5支(瓶),置各培养基规定的温度培养14天,应无菌生长。
灵敏度检查
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)〔CMCC(B) 26 003〕
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)〔CMCC(B)63 501〕
生孢梭菌(Clostridium sporogenes)〔CMCC(B) 64 941〕
白色念珠菌(Candida albicans)〔CMCC(F) 98 001〕
黑曲霉(Aspergillus niger)〔CMCC(F) 98 003〕
菌液制备 接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨培养基中或胰酪大豆胨琼脂培养基上,接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中,30℃~35℃培养18小时~24小时;接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中或沙氏葡萄糖琼脂培养基上,20~25℃培养24~48小时,上述培养物用PH7.0无菌氧化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100 cfu(菌落形成单位)的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上,20~25℃培养5~7天,加入3~5ml 含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱。然后,用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内,用含0.05%(v/v)聚山梨酯80的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100 cfu的孢子悬液。
培养基接种 取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基7支,分别接种小于100 cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌各2支,另1支不接种作为空白对照,置30~35℃培养3天;取每管装量为9ml的胰酪大豆胨液体培养基7支,分别接种小于100 cfu的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2支,另1支不接种作为空白对照,20~25℃培养5天。逐日观察结果。
结果判定 空白对照管应无菌生长,若加菌的培养基管均生长良好,判该培养基的灵敏度检查符合规定。
配制方法
验证时,按“供试品的无菌检查”的规定及下列要求进行操作。对每一试验菌应逐一进行验证。
菌种及菌液制备
除大肠埃希菌(Escherichia coli)〔CMCC(B) 4 4102〕外,金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌株及菌液制备同培养基灵敏度检查。大肠埃希菌的菌液制备同金黄色葡萄球菌。
薄膜过滤法
取每种培养基规定接种的供试品总量按薄膜过滤法过滤,冲洗,在最后一次的冲洗液中加入小于100 cfu的试验菌,过滤。取出滤膜接种至硫乙醇酸盐流体培养基或胰酪大豆胨液体培养基至滤筒内。另取一装有同体积培养基的容器,加入等量试验菌,作为对照。置规定温度培养3~5天,各试验菌同法操作。
直接接种法
取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙醇酸盐流体培养基6管,分别接入小于100 cfu的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌各2管,取符合直接接种法培养基用量要求的胰酪大豆胨液体培养基6管,分别接入小于100 cfu的白色念珠菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉各2管。其中1管接入每支培养基规定量的供试品量,另1管作为对照,按置规定的温度培养3~5天,各试验菌同法操作。
结果判断
与对照管比较,如含供试品各容器中的试验菌均生长良好,则说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计,照此检查方法和检查条件进行供试品的无菌检查。如含供试品的任一容器中的试验菌生长微弱、缓慢或不生长,则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用,可采用增加冲洗量、增加培养基的用量、使用中和剂或灭活剂、更换滤膜品种等方法,消除供试品的抑菌作用,并重新进行方法验证试验。
方法适用性验证试验也可与供试品的无菌检查同时进行。
检验数量是指一次试验所用供试品最小包装容器的数量。除另有规定外,出厂产品按表1规定;上市产品监督检验按表2、表3规定。表1、表2、表3中最少检验数量不包括阳性对照试验的供试品用量。一般情况下,供试品无菌检查若采用薄膜过滤法,应增加1/2的最小检验数量作阳性对照用;若采用直接接种法,应增加供试品1支(或瓶)作阳性对照用。
是指一次试验所用的供试品总量(g或ml)。除另有规定外,每份培养基接种的供试品量按表2、表3规定。若每支(瓶)供试品的装量按规定足够接种两份培养基,则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基。采用薄膜过滤法时,检验量应不少于直接接种法的总接种量,只要供试品特性允许,应将所有容器内的全部内容物过滤。
应根据供试品特性选择阳性对照菌:无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品,以金黄色葡萄球菌为对照菌;抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌;抗厌氧菌的供试品,以生孢梭菌为对照菌;抗真菌的供试品,以白色念珠菌为对照菌。阳性对照试验的菌液制备同方法验证试验,加菌量小于100cfu,供试品用量同供试品无菌检查每份培养基接种的样品量。阳性对照管培养48~72小时应生长良好。
除另有规定外,按下列方法进行供试品处理及接种培养基。
薄膜过滤法 一般应采用封闭式薄膜过滤器,也可使用一般薄膜过滤器。无菌检查用的滤膜孔径应不大于0.45μm。直径约为50mm。根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质。抗生素供试品应选择低吸附的滤器及滤膜。滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。使用时,应保证滤膜在过滤前后的完整性。
水溶性供试液 过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品,其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率,应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后,若需要用冲洗液冲洗滤膜,每张滤膜每次冲洗量一般为100ml,总冲洗量不得超过1000ml,以避免滤膜上的微生物受损伤。
水溶液供试品取规定量,直接过滤,或混合至含适量稀释液的无菌容器内,混匀,立即过滤。如供试品具有抑菌作用或含防腐剂,须用冲洗液冲洗滤膜,冲洗次数一般不少于3次,所用的冲洗量、冲洗方法同方法验证试验。除生物制品外,一般样品冲洗后,1份滤器中加入100ml硫乙醇酸盐流体培养基,1份滤器中加入100ml胰酪大豆胨培液体养基。生物制品样品冲洗后,2份滤器中加入100ml硫乙醇酸盐流体培养基,1份;v起加入100ml胰酪大豆胨液体培养基容器中。
水溶性固体制剂供试品 取规定量,加适宜的稀释液溶解或按标签说明复溶,然后照水溶液供试品项下的方法操作。
非水溶性制剂供试品 取规定量,直接过滤;或混合溶于含聚山梨酯80或其他适宜乳化剂的稀释液中,充分混合,立即过滤。用含0.1~1%聚山梨酯80的冲洗液冲洗滤膜至少3次。滤膜于含或不含聚山梨酯80的培养基中培养。接种培养基照水溶液供试品项下的方法操作。
可溶于十四烷酸异丙酯的膏剂和粘性油剂供试品 取规定量,混合至适量的无菌十四烷酸异丙酯①中,剧烈振摇,使供试品充分溶解,如果需要可适当加热,但温度不得超过44℃,趁热迅速过滤。对仍然无法过滤的供试品,于含有适量的无菌十四烷酸异丙酯中的供试液中加入不少于100ml的稀释液,充分振摇萃取,静置,取下层水相作为供试液过滤。过滤后滤膜冲洗及接种培养基照非水溶性制剂供试品项下的方法操作。
无菌气(喷)雾剂供试品 取规定量,将各容器置-20℃或其他适宜温度冷冻约1小时,取出,以无菌操作迅速在容器上端钻一小孔,释放抛射剂后再无菌开启容器,并将供试液转移至无菌容器中,然后照水溶液或非水溶性制剂供试品项下的方法操作。
装有药物的注射器供试品 取规定量,排出注射器中的内容物置无菌容器中,若需要可吸入稀释液或标签所示的溶剂溶解,然后照水溶液或非水溶性制剂供试品项下的方法操作。同时应采用直接接种法进行包装中所配带的无菌针头的无菌检查。
具有导管的医疗器具(输血、输液袋等)供试品 取规定量,每个最小包装用50~100ml冲洗液分别冲洗内壁,收集冲洗液于无菌容器中,然后照水溶液供试品项下方法操作。同时应采用直接接种法进行包装中所配带的针头的无菌检查。
直接接种法 适用于无法用薄膜过滤法进行无菌检查的供试品,即取规定量供试品分别接种至各含硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基中。除生物制品外,一般样品无菌检查时两种培养基接种的瓶或支数相等;生物制品无菌检查时硫乙醇酸盐液体培养基和胰酪大豆胨液体培养基接种的瓶或支数为2:1.除另有规定外,每个容器中培养基的用量应符合接种的供试品体积不得大于培养基体积的10%,同时,硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于15ml,胰酪大豆胨液体培养基每管装量不少于10ml。供试品检查时,培养基的用量和高度同方法验证试验。
混悬液等非澄清水溶液供试品取规定量,等量接种至各管培养基中。
肠线、缝合线等供试品 肠线、缝合线及其它一次性使用的医用材料按规定量取最小包装,无菌拆开包装,接种于各管足以浸没供试品的适量培养基中。
上述含培养基的容器按规定的温度培养14天。接种生物制品供试品的硫乙醇酸盐流体培养基的容器应分为两等分,一份置30~35℃培养,一份置20~25℃培养。培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长,如在加入供试品或在培养过程中,培养基出现浑浊,培养14天后,不能从外观上判断有无微生物生长,可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中,培养3天,观察接种的同种新鲜培养基是否再出现浑浊;或取培养液涂片,染色,镜检,判断是否有菌。
阳性对照管应生长良好,阴性对照管不得有菌生长。否则,试验无效。
若供试品管均澄清,或虽显浑浊但经确证无菌生长,判供试品符合规定;若供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长,判供试品不符合规定,除非能充分证明试验结果无效,即生长的微生物非供试品所含。当符合下列至少一个条件时方可判试验结果无效:
试验若经确认无效,应重试。重试时,重新取同量供试品,依法检查,若无菌生长,判供试品符合规定;若有菌生长,判供试品不符合规定。
表1 批出厂产品及生物制品的原液和半成品最少检验数量
供试品 | 批产量N(个) | 接种每种培养基所需的最少检验数量 |
注射剂 大体积注射剂(>100 ml) | ≤100 100<N≤500 >500 | 10%或4个(取较多者) 10个 2%或20个(取较少者) 2%或10个(取较少者) |
冻干血液制品 >5ml ≤5ml | 每柜冻干≤200 每柜冻干>200 ≤100 100<N≤500 >500 | 5个 10个 5个 10个 20个 |
眼用及其他非注射产品 | ≤200 >200 | 5%或2个(取较多者) 10个 |
桶装无菌固体原料 抗生素固体原料药(≥5克) | ≤4 4<N≤50 >50 | 每个容器 20%或4个容器(取较多者) 2%或10个容器(取较多者) 6个容器 |
生物制品原液或半成品 | - | 每个容器(每个容器制品的取样量为 总量的0.1%或不少于10ml,每开瓶一 次,应如上法抽样) |
体外用诊断制品半成品 | - | 每批(抽验量应不少于3ml) |
医疗器具 | ≤100 100<N≤500 >500 | 10%或4件(取较多者) 10件 2%或20件(取较少者) |
注:若供试品每个容器内的装量不够接种两种培养基,那么表中的最少检验数量应增加相应倍数。
表2 上市抽验样品的最少检验数量
品种及装量(V) | 最少抽验量 |
液体制剂 | 10 |
固体制剂 | 10 |
血液制品V<50ml V≥50ml | 6 2 |
医疗器具 | 10 |
注:①若供试品每个容器内的装量不够接种两种培养基,那么表中的最少检验数量应增加相应倍数。
表3 供试品的最少检验量
供试品 | 供试品装量 | 每支(瓶)供试品接入每种 培养基的最少接种量 |
液体制剂 | ≤1ml 1ml<V≤40ml 40ml<V≤100ml V>100ml | 全量 半量,但不得少于1ml 20ml 10%但不少于20ml |
固体制剂 | M <50mg 50mg≤M<300mg 300mg≤M<5g M≥5g | 全量 半量 150mg 半量 |
生物制品的原液及半成品 | - | 半量 |
医疗器具 | 外科用敷料棉花及纱布 缝合线、一次性医疗材料 带导管的一次性医疗器具(如输液袋) 其他医疗器具 | 取100mg或1cmX3cm 整个材料① 二分之一内表面积 整个器具①(切碎或拆散开) |
①如果医疗器械体积过大,培养基用量可在2000ml以上,将其完全浸没 [1]。