培养流感病毒H5N1减毒疫苗为何不用鸡胚细胞而用其他细胞，如MDCK?

A型和B型流感病毒都可以用鸡胚培养，这里也包括H5N1。对于禽源性流感病毒来说，不管是分离敏感性和病毒增值效果来说，鸡胚分离都优于细胞分离培养。鸡胚分离培养的优点还有抗污染能力好，因为是胚体细胞，增值的病毒适合生产疫苗。但鸡胚法也有缺点，对人源性流感病毒敏感性低于细胞分离，还有必竞鸡胚还是有免疫系统，在免疫系统的压力下病毒容易发生变异。鸡胚分离对种蛋要求也很高，一般需要使用SPF种蛋，种蛋供应不方便实验室小规模使用。

细胞培养分离好处有，细胞种子实验室保存方便，分离人源性流感病毒敏感性好。病毒不容易产生变异，但细胞系属于癌细胞，不能用于生产疫苗，而且在分离培养A型B型流感病毒的传代过程中，从5代以有随着传代次数增加反而滴度下降的现象。

所以说鸡胚分离适合于厂家生产，细胞分离适合于实验室。

Part 1. 流感疫苗的发展

流感是一种高度传染性疾病，目前商业规模上使用最广泛的疫苗类型为灭活流感疫苗和亚单位疫苗。流感疫苗由一种或多种病毒株组成，这些病毒株通常在胚胎母鸡蛋的尿囊腔中产生。

由鸡胚生产疫苗有许多缺点：

• 病毒选择性复制导致低免疫原性；
• 劳动强度大、产量低，流感大爆发时难以满足需求；
• 抗原间存在差异；
• 若流感起源于禽类，在鸡蛋中获得的疫苗可能对人体致命；
• 卵源成分可能引起接种者发烧和致病[1]。

细胞培养的流感病毒有很多优势：

• 高免疫原性；
• 容易大规模生产，降低劳动强度，更快制备且产量高；
• 封闭化生产，无细菌污染；
• 标准化制备，具有更高初始纯度；
• 标准化流程，减少批次间差异；
• 为鸡蛋过敏的人提供了选择。

Part 2. MDCK细胞应用疫苗情况

MDCK 细胞与病毒亲和性高、增殖速度快且不易发生突变，目前被认为是适合用于甲、乙型流感疫苗生产的细胞系之一。

MDCK最初需要贴壁培养，但传统二维平面培养不利于逐级放大，随着微载体的发现和使用，这个问题逐渐得到解决。微载体可实现贴壁细胞悬浮培养，可有效增大一批次细胞培养量和病毒收获量。

Part 3. 3D微载体培养MDCK细胞工艺简介

对于贴壁MDCK，使用微载体/反应器工艺是目前大规模培养流感病毒传播所需细胞的最佳选择，因为它们具有高的比表面积，可使用生物反应器进行大规模培养，并且可以更好地监测和控制。

微载体悬浮培养技术可以在搅拌式生物反应器中进行

应用3D TableTrix®微载体，在3D FloTrix® miniSPIN 生物反应器中可实现细胞育种，配合3D FloTrix® vivaSPIN 自动化生物反应器可实现细胞量的逐级放大，完成细胞、病毒以及细胞产物的收获。温度、溶氧、pH、转速、Air、 O_{2} 、 CO_{2} 、 N_{2} 等细胞培养工艺参数可实现高精度、自动化控制，为细胞提供良好的环境，有助于细胞的增殖。通过设置自动换液程序（表1），为细胞生长提供充足的营养，并维持良好的生长环境，最终达到近1000万/mL的细胞密度。

与二维培养相比

大批量培养细胞时降低了在空间、人工、试剂耗材和时间上的成本，同时极大提高了细胞密度，目前基于3D TableTrix® 微载体的贴壁培养已达到与全悬浮培养相似的细胞密度[3]。而相较于悬浮细胞培养，贴壁培养避免了悬浮细胞致瘤的可能，并能在感染病毒时减少细胞损失，具有明显的优势。

Part 4. 连续放大传代工艺

• 微载体：3D TableTrix®微载体（V系列）
• 反应器：125mL 透气内置叶轮培养瓶（SF125）
• 连续传代思路：50万/mL的细胞密度接种，3天内增殖5倍及以上，1：5进行传代。
• 方法：用PBS原瓶清洗3次去除血清残留，加入重组胰酶消化10-30min后细胞从载体上脱落（图6），用完全培养基终止消化。对应量的细胞和微载体泵入下一级反应器进行放大培养（图7）。

Part 5. 结论

3D TableTrix®微载体（V系列）可实现MDCK细胞在生物反应器中悬浮培养，并进行传代扩增，最高细胞密度达到1000万/mL。总的来说，使用3D TableTrix®微载体（V系列）配合3D FloTrix®vivaSPIN 自动化生物反应器的独特优势，可在短时间内收获期望的细胞量，极大地满足了科研及生产的需求，为疫苗企业带来了新的动力。

参考文献

[1] FENG, S.-Z., JIAO, P.-R., QI, W.-B., et al. Development and strategies of cell-culture technology for influenza vaccine[J]. Applied Microbiology and Biotechnology,2011,89(4):893-902. DOI:10.1007/s00253-010-2973-9.

[2] GREGERSEN JP, SCHMITT HJ, TRUSHEIM H, et al. Safety of MDCK cell culture-based influenza vaccines.[J]. Future microbiology,2011,6(2):143-152. DOI:10.2217/fmb.10.161.

[3]赵彩红,王美皓,李自良,靳冬武,马花,马忠仁,乔自林,陈宏,张家友,王家敏.无血清悬浮培养MDCK细胞系的建立及生物反应器高密度培养[J].中国生物制品学杂志,2021,34(11):1362-1369.DOI:10.13200/j.cnki.cjb.003482.