Strasberg nació en Budanov, ciudad del Imperio austrohúngaro, actual Ucrania. Fueron sus padres Ida y Baruch Meyer Strasberg. En 1931, fue uno de los fundadores del Group Theatre, una compañía que contó con la participación de Elia Kazan, John Garfield, Stella Adler, Sanford Meisner, Franchot Tone y Robert Lewis.
En 1949, comenzó una larga carrera en el Actors Studio de Nueva York, convirtiéndose a los dos años en su director artístico. Bajo su tutela se cuentan actores como Geraldine Page, Paul Newman, Al Pacino, Kim Stanley, Marilyn Monroe, Jane Fonda, James Dean, Dustin Hoffman, Eli Wallach, Marlon Brando, Eva Marie Saint, Robert De Niro, Jill Clayburgh, Jack Nicholson, y Steve McQueen.
En 1966 fundó una sucursal del Actors Studio en Los Ángeles, y tres años más tarde fundará el Lee Strasberg Theatre and Film Institute.
Su vocación pedagógica lo convirtió en uno de los principales impulsores de lo que se conoce como «El Método» inspirado en el Sistema Stanislavski.
Sólo interpretó roles destacados en unas pocas películas. Probablemente su interpretación más famosa (y que le significó la nominación al Oscar) fue en la segunda parte de El Padrino, donde encarnó a Hyman Roth, un mafioso judío jubilado que supervisaba desde Miami el crimen organizado de Cuba. El personaje está basado en el famoso mafioso judío Meyer Lansky, que construyó un hotel de lujo en La Habana que perdió en la Revolución.