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当前绝大部分获批的新冠疫苗采用的接种方式是肌肉注射，这对于早期的新冠毒株具有非常高的预防保护效果，可达到 95%。随着新冠变异株免疫不断涌现，其免疫逃脱能力和传播力也得到进一步提升，导致肌注式疫苗免疫保护效果显著下降，针对当前流行的 Omicron 变异株（例如，BQ.1.1 和 XBB.1）的免疫保护效果只能达到 30-50%。
呼吸道是抵御新冠病毒入侵的第一道防线，肌注式疫苗无法有效触发黏膜免疫，在控制病毒复制和病毒上呼吸道鼻腔脱落方面效果不佳，相比之下，鼻腔疫苗在病毒入侵的初始部位引发强烈的保护性免疫应答。除了无创无针递送的优势外，鼻腔疫苗在触发上呼吸道消除性免疫（ sterilizing immunity）方面具有显著优势，因此，不仅可以防御症状性疾病，还可以预防无症状传播。
研究者开始尝试口服、鼻腔或者吸入式新冠疫苗，旨在触发黏膜 B 细胞和 T 细胞反应，能够更好地预防新冠病毒感染和传播。全球范围内，大概有 100 种不同的黏膜新冠疫苗处于开发之中。印度巴拉特生物技术公司开发的基于黑猩猩腺病毒（chimpanzee Adenoviruses，ChAds）载体的鼻腔接种新冠病毒疫苗和中国康希诺开发的基于复制缺陷型人腺病毒 5 型（adenovirus type-5，Ad5）吸入式新冠病毒疫苗均已获批上市，两者均编码新冠病毒原始株 Spike 抗原，用于初次免疫或者加强免疫。
印度巴拉特生物技术公司生产的 iNCOVACC®鼻腔新冠病毒疫苗，以复制缺陷型大猩猩腺病毒为载体，编码基于 Wuhan-1 原始株的 Spike 蛋白（ChAd-SARS-CoV-2-S）。Spike 序列采用 2P 突变，从而表达稳定的融合前构象蛋白。华盛顿大学医学院 Michael S. Diamond 等人是 ChAd-SARS-CoV-2 技术的发明者，而印度巴拉特生物技术公司从华盛顿大学获得该项技术的商业生产授权。Michael S. Diamond 还是众多知名医药公司的科学顾问，例如，GSK，Moderna，Inbios，Ocugen，Vir Biotechnology 等。
2023 年 5 月 4 号，Michael S. Diamond 团队在 BioRxiv 上传预印本文章：A bivalent ChAd nasal vaccine protects against SARS-CoV-2 BQ.1.1 and XBB.1.5 1 infection and disease in mice and hamsters，他们设计出ChAd-SARS-CoV-2-BA.5-S 鼻腔迭代新冠疫苗，编码 Omicton 变异株 BA.5 Spike 蛋白。Spike 序列采用 6P 突变，同时突变 Furin 切割位点（RRARS→GSASS），旨在高效表达稳定的融合前构象Spike蛋白。
ChAd 疫苗触发的系统性和黏膜抗体反应
在小鼠中，采用鼻腔接种递送基于 ChAd 载体的新冠病毒疫苗触发强烈的系统性血清 IgG 和 IgA 反应。单价 ChAd 疫苗能够触发更强烈的、靶向同源型新冠病毒株的特异性抗体反应，而二价 ChAd 疫苗触发针对原始株和 Omicron 变异株（BA.5.5，XBB.1，BQ.1.1）更加均衡的血清 IgG 和 IgA 反应。这些数据与先前采用肌肉注射新冠 mRNA 二价疫苗得到的数据是一致的，也就是说，相比于单价疫苗，二价疫苗触发更加广谱的血清抗体反应。
除了系统性血清抗体反应，在小鼠肺泡灌洗液（BALF）中，采用鼻腔递送二价 ChAd 疫苗同样触发更加广谱的 IgG 和 IgA 黏膜抗体反应。不管是编码新冠原始株 Spike 蛋白的 ChAd-SARS-CoV-2-S，还是编码 BA.5 Spike 蛋白的 ChAd-SARS-CoV-2-BA.5-S，两者均在血清和肺泡灌洗液中触发的靶向 XBB.1 的中和抗体滴度极低。这可能是由于 XBB.1 分支的 Spike 蛋白在 NTD 和 RBD 存在额外突变，使其能够逃脱由 Wuhan-1 或者 BA.4/5 抗原触发所产生的的中和抗体。
ChAd 疫苗触发黏膜驻留记忆 T 细胞
在先前接种疫苗或混合免疫（hybird immunity）的情况下，记忆 T 细胞可控制 SARS-CoV-2 的感染和复制，特别是在血清中和抗体滴度较低的时候。CD69+103+组织驻留记忆 T 细胞（TRM）是关键的局部黏膜免疫效应细胞，能够快速响应或者分化，从而控制呼吸道病毒感染。采用鼻腔接种递送单价或者二价 ChAd 疫苗均能在小鼠肺部组织和小鼠肺泡灌洗液（BALF）中触发特异性的 CD8+TRM 细胞。而且，编码 BA.5 Spike 的单价或者二价 ChAd 疫苗触发的TRM反应和编码 Wuhan-1 Spike 的单价 ChAd 疫苗触发的 TRM 反应程度相当，这可能是由于 Spike 蛋白的显性表位在各个新冠变异株中相当保守。此前，有研究发现人体接种 BA.5-二价 mRNA 疫苗后，触发产生的中和性抗体能够被 XBB 分支毒株大幅逃逸，但是，诱导产生的 T 细胞仍然会识别 XBB 分支毒株。
攻毒测试评估抗体反应和免疫保护效果
鼻腔免疫 2 个月后，K18-hACE2 小鼠进行攻毒测试。接种 3 种类型 ChAd 疫苗的小鼠均未出现 WA1/2020 或者 XBB.1.5 引发的体重减轻现象，均未在鼻腔和鼻甲中检测到 WA1/2020 或者 BQ.1.1 感染。虽然血清或者肺泡灌洗液中靶向 XBB.1.5 的中和抗体滴度非常低，但是，在接种 3 种类型 ChAd 疫苗小鼠的上呼吸道只检测到极其微量的 XBB.1.5 感染(102 N gene/mg)。通过被动免疫证实，ChAd 疫苗免疫小鼠后触发的针对 XBB.1.5 的免疫保护效果由除了血清抗体反应以外的其他免疫机制介导。
在肺部（下呼吸道），单价或者二价 ChAd 疫苗均能很好地预防小鼠感染测试毒株，然而，接种单价 ChAd 疫苗的小鼠会出现更多的异源型毒株感染。肺部 XBB1.5 突破性感染在接种单价或者二价 ChAd 疫苗的小鼠上均会出现，但是，接种二价价 ChAd 疫苗的小鼠肺部的病毒载量更低，病理损伤更小，展现出更加广谱性的预防效果，即便是 XBB.1.5 的突破性感染，也只能检测到极低的滴度（900 N gene /mg）。
一般认为，中和抗体水平与疫苗触发的免疫保护效果密切相关。接种单价或者二价 ChAd 疫苗的小鼠触发的靶向 WA1/2020 或者 BQ1.1 的抗体滴度水平（血清中和抗体、IgG 结合抗体以及 IgA）和肺部病毒载量呈现负相关性。这种负相关性在 XBB.1.5 毒株攻毒测试中并未发现，这可能是由于 XBB.1.5 强烈的免疫逃脱能力造成的。
ChAd 疫苗免疫叙利亚仓鼠的保护效果
叙利亚仓鼠天然易感新冠病毒，经常作为临床前动物模型评估候选新冠病毒疫苗保护效果。单价（Wuhan-Spike）或者二价 ChAd 疫苗鼻腔接种免疫叙利亚仓鼠，触发的靶向新冠原始株 WA1/2020 的血清抗体反应程度是相当的，然而，二价 ChAd 疫苗触发更高水平的靶向 BA.5 或者 XBB.1.5 的血清抗体反应。而且，二价 ChAd 疫苗免疫小鼠的上下呼吸道中也具有更低的病毒载量。
结论
鼻腔接种 ChAd 疫苗能够有效触发靶向同源新冠病毒株的系统性免疫反应和黏膜免疫反应，而且，二价 ChAd 疫苗能够触发更加广谱性的免疫反应。单价或者二价 ChAd 疫苗均无法触发高水平的靶向 XBB.1.5 的血清中和抗体反应，但是，二价 ChAd 疫苗在呼吸道黏膜能够触发强烈的抗体反应和记忆 T 细胞反应，诱发针对新冠原始株和 Omicron 变异株更加广谱性的预防效果。在攻毒试验中，二价 ChAd 疫苗免疫的小鼠呼吸道具有更低的病毒载量，肺部病理性损伤也更轻。最重要的是，通过这项研究，我们可以清楚地看到，以腺病毒以载体的新冠疫苗，采用鼻腔接种的方式，即便在触发的血清或者肺泡灌洗液的中和抗体水平很低的情况下，也能使得小鼠对新冠变异株表现出强烈的免疫预防效果。
当然，这项研究还存在诸多不足之处：第一，由于肺泡灌洗液的获取具有侵略性，只能在试验终止点操作，因此无法将黏膜IgA和肺部T细胞反应和ChAd免疫保护效果之间建立联系；第二，这项研究均是在ChAd疫苗免疫小鼠2个月后进行免疫反应分析和保护效率测试，应该在更长的时间范围检测ChAd疫苗触发的黏膜免疫和系统性免疫的持续时间；第三，这项研究中ChAd疫苗均是单剂量接种，应该进行加强免疫或者混合免疫背景下检测疫苗保护效果；第四，ChAd疫苗触发强烈的TRM反应，但是，并未证实其在免疫保护方面的作用，需要在CD8+T细胞缺乏的小鼠中进行攻毒测试。第五，未来还需要在非人灵长类动物模型以及人体验证该项工作的得到的数据。
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黏膜疫苗是利用激活机体黏膜和系统的免疫应答控制感染性疾病而发挥作用的疫苗，不仅可通过激活机体黏膜和系统的免疫应答阻止病原微生物的入侵,还可通过诱导抗原特异性黏膜耐受选择性地治疗自身免疫性疾病、变态反应性疾病及感染性的免疫病理紊乱等。黏膜疫苗与肌肉注射疫苗相比的一个重要优势，是可以防止病毒在上呼吸道复制，阻断人与人之间的传播。根据免疫类型不同，黏膜疫苗可分为鼻内和吸入，目前临床常用的主要是鼻腔喷雾剂疫苗。
与肌肉注射相比，鼻腔喷雾剂疫苗可能会对COVID-19等传染病产生更强大的保护性粘膜免疫反应。然而，许多鼻内疫苗，包括目前正在临床试验的COVID-19鼻内疫苗(NCT04816019、NCT04839042、NCT04798001和NCT04954287)，都是基于病毒载体，受病毒成分免疫原性的限制，容易引起机体非必要的免疫反应，甚至造成细胞毒性反应。与这些基于病毒的方法相比，非病毒生物材料配方可能会为鼻腔喷雾等黏膜疫苗生产提供更安全的替代方案。
近日，美国马里兰大学菲切尔生物工程系的Gregg A. Duncan 和Katharina Maisel教授联合在《Nature》旗下最新子刊《Nature Reviews Bioengineering》上发表题为“Biomaterials for intranasal and inhaled vaccine delivery” 的评论性文章（图1）。
在这篇评论中，他们讨论了不同黏膜疫苗佐剂的理化性质，总结了非病毒生物材料用于黏膜疫苗生产的优势及特异性的免疫学功能，强调了如何设计生物材料以实现鼻内和吸入接种，为黏膜疫苗的研发和生产提供了指导性意见。
图1
呼吸系统输送障碍
对于包括COVID-19在内的许多呼吸道传染病，针对上呼吸道的疫苗可能是预防鼻部初始感染的最佳方法。为了达到这一目的，可以通过控制疫苗雾化后的液滴大小调控其靶向区域。例如将液滴雾化到在微米范围内可靶向鼻腔或气管区域，雾化到亚微米范围内可靶向支气管区域。经呼吸道接种的疫苗需要克服各种气道障碍才能发挥作用(图2)。气道内的粘液对吸入物质起半透性屏障的作用，呼吸道上皮表面的活动纤毛通常会迅速清除异物。根据其大小和表面化学性质，由核酸、脂类、聚合物、蛋白质或整个病毒组成的疫苗纳米制剂在吸入后常被阻滞在粘液中。例如，用于开发针对SARS-CoV-2、HIV和结核病疫苗的腺病毒载体辉粘附在粘液上，限制病毒到达目标细胞(例如，肺树突状细胞)，降低粘膜免疫反应能力。
而非病毒疫苗平台，如基于脂质的mRNA疫苗，则可克服粘液屏障，从而可能成功实现呼吸道疫苗接种。例如，与肌肉注射无载体疫苗相比，用聚乙二醇(PEG)包被的吸入式纳米颗粒疫苗可以迅速穿透粘液屏障，增强肺和淋巴结中抗原特异性T细胞的增殖。
图2
生物材料可作为载体和佐剂
脂质纳米颗粒可用于包封核酸或蛋白质，保护包裹物不被核酸酶和蛋白酶降解。例如用于抗COVID-19的mRNA疫苗，其采用脂质纳米颗粒包裹mRNA，依靠脂质纳米颗粒固有的辅助功能，促进辅助性T细胞和B细胞的成熟和增殖。除了基于脂质的载体配方外，疫苗还可以由携带核酸的阳离子聚合纳米颗粒制成。其中，聚乙烯亚胺(PEI)被用于鼻腔吸入疫苗的研发。例如，mRNA可被包裹在PEI结合环糊精中，构建针对寨卡病毒感染的鼻内疫苗，与单独PEI相比，这种包裹方式可以更有效地靶向淋巴结并降低毒性。含有SARS-CoV-2受体结构域的肺源外泌体也可用于设计吸入疫苗，这种疫苗已在小鼠上验证能在气道中产生强大的免疫反应。
另外，自组装肽(由CD8+ T细胞表位与β-片状纳米纤维组装结构域融合而成)也被用于吸入性疫苗研发，并且可通过调整材料特性(如形状、大小、电荷和表面组成)提高免疫原性。基于肽的两亲性抗原免疫偶联物，可自组装成纳米级胶束，用于粘膜疫苗接种，经鼻内递送时，这些免疫原纳米颗粒被有效地运输到鼻相关淋巴组织(NALT)中，诱导抗原特异性黏膜IgA 和血清IgG应答，并能持续存在于鼻子和其他粘膜组织发挥作用。
在疫苗开发过程中，根据所需的免疫反应选择适用于呼吸道和粘膜传递的佐剂至关重要。粘膜部位有效的疫苗接种需要适当的佐剂辅助才能够产生强大的IgA抗体反应，并通过激活B细胞和树突状细胞诱导全身免疫。例如，铝盐是注射疫苗中广泛使用的佐剂，但在粘膜疫苗中使用却不会诱导IgA抗体分泌。粘膜给药佐剂通常是免疫刺激分子，如细胞因子、toll样受体(TLRs)或其他病原体等。特别是TLR激动剂，如胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(CpG, TLR9)和聚肌苷:聚胞苷酸(Poly:IC, TLR3)在低剂量下具有良好的耐受性，并可在粘膜部位产生强烈的B细胞反应。其他生物材料，如壳聚糖，也可作为鼻内疫苗的佐剂，能产生强烈的粘膜免疫反应。
前景
普通的鼻内疫苗平台，通常是基于传统疫苗接种技术设计的。然而，鼻内疫苗应设计为针对NALT中特定细胞，如M细胞，这些细胞负责抗原摄取并在粘膜区室中产生特异性免疫反应。基于纳米颗粒的给药系统也可用于开发助推器，这种助推器可以重复给药，而不诱导通常与病毒载体相关的免疫原性。目前正在进行针对COVID-19鼻内和吸入疫苗的几项临床试验。
然而，鼻内和肺给药方法缺乏合适的动物模型阻碍了其临床发展。因此，开发模仿人体呼吸和黏膜屏障的新技术和设备对于黏膜疫苗的研发是必要的。此外，干粉制剂的进步可能会研制出比液体制剂保质期更长的吸入式疫苗，也可改善在资源匮乏环境下疫苗的全球运输和使用。