Cuando Estefanía tenía once años, su padre abdicó sus derechos al Principado en nombre del Rey de Prusia, y se trasladó con su familia al Palacio de Jägerhof en Dusseldorf, Alemania, donde creció en medio de hermosos jardines.

La Princesa llegó a la ribera del río Tajo, Portugal, el 17 de mayo de 1858. Al día siguiente, el 18 de mayo de 1858, en la iglesia de Santo Domingo en Lisboa, Portugal, la Princesa Estefanía de Hohenhollern-Sigmaringen se casó con el Rey Pedro V de Portugal. Pasaron su luna de miel en Sintra, donde el Rey no escatimó en gastos en la decoración de las habitaciones a fin de impresionar a su esposa. La nueva Reina no veía con buenos ojos la alta sociedad portuguesa, donde sobraban el lujo y la pompa, pero faltaba dignidad. Junto con su marido, Estefanía fundó varios hospitales y organizaciones benéficas, que le valió un aura de gran popularidad entre los portugueses de todas las ideologías políticas y sociales.

Poco tiempo después de su matrimonio, la Reina Estefanía murió víctima de la difteria, el 17 de julio de 1859 en Lisboa, a los 22 años de edad. La enfermedad fue contraída durante una visita a Turquía. La muerte de la Reina, no sólo consternó al Rey, sino también a toda la población en general que le tenía gran afecto. Debido a su temprana muerte, la pareja no llegó a engendrar ningún hijo.

Los restos de la Reina Estefanía de Portugal, se encuentran en el Panteón de la Dinastía de los Braganza, en el Monasterio de San Vicente de Fora, en Lisboa. Su marido murió dos años más tarde, a causa de la fiebre tifoidea.