El fondo inicial se formó con las colecciones reales, a las que se unieron, a principios del siglo XVIII, los manuscritos que habían acompañado a Felipe V desde Francia y los de las bibliotecas nobiliarias incautadas en la Guerra de Sucesión, en especial las bibliotecas pertenecientes a Gaspar Ibáñez de Segovia y Peralta, marqués de Mondéjar (1708) y a Juan Francisco Pacheco Téllez Girón, duque consorte de Uceda (1711). Dos importantes permutas con el Convento de Santo Tomás de Ávila y con el Convento de San Vicente de Plasencia y la adquisición de bibliotecas nobiliarias y de eruditos enriquecerán considerablemente la colección de manuscritos en este primer siglo de existencia.

A lo largo del siglo XIX se incorporarán por compra bibliotecas particulares como las de Juan Nicolás Böhl de Faber, Agustín Durán o Serafín Estébanez Calderón. Sucesivos decretos de desamortización sobre los bienes artísticos, bibliográficos y documentales de la Iglesia tuvieron como consecuencia la entrada en diversos museos, archivos y bibliotecas del Estado, de parte importante de dichos bienes. De ese modo llegaron a la Biblioteca Nacional un conjunto de antiguos manuscritos de gran interés artístico y codicológico. Si hay un año clave en el incremento de la colección de manuscritos es 1886, en que se adquiere la biblioteca de la casa ducal de Osuna e Infantado, con la que ingresa la biblioteca del Marqués de Santillana y la biblioteca de los Condes de Benavente. La compra de la biblioteca de Pascual de Gayangos, de gran diversidad temática y cronológica, será otro importante hito en la colección, a la que se unirá la donación de la biblioteca de Luis Usoz y Río y de los papeles del compositor Francisco Asenjo Barbieri.

La donación del códice del Cantar de Mío Cid en 1960 será otra fecha estelar, comenzando un período de diversidad en los manuscritos que se incorporan a la colección, que perdura hasta la actualidad. En los últimos años, la llegada de epistolarios de importantes figuras de la literatura contemporánea como Rafael Morales, Roberto Bolaño o la hispanista Mathilde Pomés ha situado la colección de manuscritos de la BNE en un lugar relevante de nuestro patrimonio bibliográfico