Materiałem genetycznym większości organizmów jest DNA – kwas deoksyrybonukleinowy (ang. deoxyribonucleic acid). Zbudowany jest on z dwóch nici (łańcuchów) polinukleotydowych tworzących strukturę podwójnej helisy. Struktura ta utrzymywana jest dzięki obecności wiązań wodorowych pomiędzy zasadami azotowymi obu nici. Więcej informacji na temat budowy DNA znajdziesz w e‑materiale DNA jako nośnik informacji genetycznej.

Stabilizacja wiązań wodorowych zależy m.in. od stężenia soli oraz pH środowiska. Wahania tych parametrów mogą powodować destabilizację wiązań wodorowych. Natomiast wysoka temperatura (~95Indeks górny o^oC) jest głównym czynnikiem powodującym pękanie wiązań wodorowych. W konsekwencji dochodzi do separacji obu nici kwasu nukleinowego (dwuniciowego DNA). Proces rozdzielenia podwójnej nici kwasu nukleinowego określa się mianem denaturacji lub topnienia. Temperatura topnienia zależy od liczby par G‑C: im jest ich więcej, tym temperatura musi być wyższa. Na denaturację wiązań wodorowych wpływa również obecność niektórych substancji chemicznych, takich jak formamidformamidformamid.

Obniżenie temperatury lub usunięcie substancji denaturującej z badanej próby powoduje łączenie się komplementarnych jednoniciowych nici DNA w procesie zwanym renaturacją.

Renaturacja – proces, podczas którego dochodzi do odtworzenia pierwotnie dwuniciowej struktury – stanowi jeden z przykładów hybrydyzacji. Hybrydyzacja to określenie używane do opisania spontanicznego łączenia się nukleotydów różnych kwasów nukleinowych. W wyniku tego procesu może dojść do tworzenia się połączeń między pojedynczymi nićmi: DNA‑DNA, RNA‑RNA lub DNA‑RNA. Zarówno szybkość łączenia się, jak i stabilność powstałych odcinków zależą od długości fragmentów oraz podobieństwa sekwencji nukleotydów. Powstawanie stabilnych struktur dwuniciowych możliwe jest wtedy, gdy istnieją komplementarne odcinki kwasów nukleinowych o długości kilkunastu nukleotydów.

Zjawisko łączenia się komplementarnych fragmentów kwasów nukleinowych zostało wykorzystane w biologii molekularnej w technice zwanej hybrydyzacją. Polega ona na przyłączaniu wyznakowanych fragmentów kwasów nukleinowych do komplementarnych sekwencji. Takie wyznakowane izotopami lub chemicznie odcinki kwasów nukleinowych to sondy molekularne.

Sondy molekularne mogą stanowić krótkie oligonukleotydyoligonukleotydyoligonukleotydy lub długie fragmenty kwasów nukleinowych. Ważną cechą sond molekularnych jest ich znakowanie, czyli przyłączanie określonych substancji (tzw. znaczników), które umożliwiają ich detekcję oraz wykrycie komplementarnych do nich fragmentów kwasów nukleinowych. Wcześniej sondy molekularne znakowane były głównie radioaktywnymi izotopami (32P, 35S, 14C), jednak związane z nimi zagrożenia, powodujące niedogodności w pracy laboratoryjnej, doprowadziły do wynalezienia metod znakowania nieradioaktywnego. W tym celu wykorzystuje się fluorofory – substancje o zdolności do fluorescencji. Wśród nich wyróżnić można takie związki jak fluoresceinafluoresceinafluoresceina, rodaminarodamina rodamina czy cyjaninycyjaninacyjaniny.

RIOP0aYaxThAv

Na zdjęciu znajdują się wodne roztwory związków o zdolności do fluorescencji w świetle UV. Roztwory znajdują się w walcowatych zlewkach oraz w kolbie stożkowej w postaci stożka zakończonego wąskim kominem. Mają one kolor czerwony, niebieski, biały, żółty oraz zielony. Tło zdjęcia jest czarne.

Jak wspomniano, sondy molekularne wykorzystywane są w technice zwanej hybrydyzacją. Reakcje hybrydyzacji mogą być przeprowadzane w różny sposób. Z tego względu wyróżnia się hybrydyzację typu Southern blot (metodą Southerna) oraz northern blot. Techniki te stanowią podstawowe narzędzia w badaniu pojedynczych genów. Do metod opartych na hybrydyzacji należy także fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH, ang. fluorescent in situ hybrydization), która służy do identyfikacji sekwencji DNA w chromosomach lub jądrach interfazowych.

R1cWaIv8FQnWi1

Na ilustracji znajduje się fragment mikromacierzy dwukolorowej. Składa się on z punktów ustawionych w równe rzędy, które umieszczone są jeden w drugim. Punkty mają różne odcienie zielonego, od bardzo ciemny po jaskrawozielony, niemal żółty.

Modyfikacją klasycznej hybrydyzacji jest metoda mikromacierzy, polegająca na rozmieszczeniu sond molekularnych na podłożu zwanym mikromacierzą (ang. microarray). Może to być płytka szklana lub plastikowa, na której nanoszone są w regularnych odstępach sondy, różniące się sekwencjami. Do tych sond mogą przyłączać się cząsteczki DNA lub RNA, które będą wykazywały się wysokim stopniem komplementarności. W przeciwieństwie do innych metod, w przypadku mikromacierzy znakowany jest materiał badany, a nie sondy.

Dzięki miniaturyzacji technika ta pozwala na jednoczesną analizę ekspresji wielu, a czasami wszystkich genów w dwóch probówkach (np. pacjenta zdrowego i chorego). Materiał znajdujący się w obu próbkach znakowany jest różnymi barwnikami, tak aby możliwe było ich odróżnienie. Takie próbki kwasu nukleinowego hybrydyzuje się z mikromacierzą. Cząsteczki wyznakowanego kwasu nukleinowego wiążą się do komplementarnych sekwencji sond na mikromacierzy.

Odczyt mikromacierzy wykonywany jest za pomocą metody obrazowania umożliwiającej ilościowy pomiar sygnału fluorescencyjnego. Intensywność sygnału dla poszczególnych sond mikromacierzy jest proporcjonalna do ilości w próbce kwasu nukleinowego o danej sekwencji związanego z sondą. W przypadku braku różnic w ekspresji genów widoczna barwa będzie wypadkową obu znaczników. Przewaga jednego z kolorów świadczy o większej ekspresji w probówce zawierającej barwnik o danej fluorescencji.

Technika hybrydyzacji wykorzystywana jest w diagnostyce nowotworów oraz chorób zakaźnych i o podłożu genetycznym (m.in. fenyloketonurii, hemofilii). W badaniach naukowych metody oparte na hybrydyzacji stosuje się w celu analizy struktury kwasów nukleinowych, identyfikacji sekwencji powtórzonych oraz śledzenia aktywności komórek. Hybrydyzacja DNA pozwala również na określenie pokrewieństwa ewolucyjnego, a także identyfikację żywności genetycznie zmodyfikowanej. Co więcej, metoda ta jest wykorzystywana do monitorowania zmian środowiska, w tym określania bioróżnorodności mikroorganizmów.

Słownik