En ciencias biológicas, específicamente en el campo de la inmunología, la palabra ELISA, es el acrónimo de Enzyme-linked immunosorbent assay o ensayo de inmunoabsorbente ligado a enzimas, el cual es un método que permite la cuantificación de un marcador de interés en una muestra biológica. Dicho marcador puede ser un anticuerpo, una hormona, un péptido o una proteína.
Aunque el principio básico de los ensayos ELISA es similar al de los Radioinmunoensayos (RIA) y se remonta a 1941 (Coons, Creech y Jones, 1941), en un RIA el antígeno o el anticuerpo de interés se marca con radiactividad, lo cual no ocurre en un ensayo ELISA, donde se utilizan enzimas en lugar de compuestos radiactivos para marcar las moléculas de interés. Su invención se produjo simultáneamente por dos grupos de investigación distintos, que publicaron sus trabajos el mismo año (Engvall y Perlmann, 1971; Van Weemen y Schuurs, 1971), pero es usualmente atribuida al grupo de Engvall y Perlmann, quienes conjugaron los antígenos y anticuerpos con enzimas en lugar de yodo-125 (yodo radiactivo), como se hacía en los ensayos RIA, para determinar los niveles de IgG en suero sanguíneo de conejo (Engvall y Perlmann, 1971). Los dos grupos de investigación involucrados en el descubrimiento recibieron el Premio de Análisis Bioquímico en 1976.
Figura 1. Premio de Análisis Bioquímico, Munich, abril de 1976. De izquierda a derecha, Dra. Eva Engvall (Suecia), Dr. Anton Schuurs (Holanda), Dr. Peter Perlmann (Suecia), Dr. Bauke van Weemen (Holanda) y el Prof. Johannes Büttner (Alemania), Presidente de la Sociedad Alemana de Química Clínica (DGKC). Tomado de Lequin (2005).
¿Cómo funciona el método?
Un en ensayo ELISA requiere, en términos generales, de tres componentes esenciales: el antígeno a detectar o cuantificar, un anticuerpo específico para ese antígeno conjugado a una enzima que genere una reacción cuantificable y un sistema que permita estimar la cantidad de antígeno presente en la muestra a partir de la reacción enzimática que se genere. El resto de detalles variará dependiendo del tipo de ELISA.
Figura 2. Placa de 96 pocillos típicamente usada en sayos ELISA.
Actualmente se distinguen cuatro variantes de este ensayo, las cuales se detallan a continuación:
ELISA directo
Este es el tipo de ensayo descrito originalmente por Perlmann y Engvall y Van Weemen y Schuurs en 1971 (Aydin, 2015); en él la superficie de una placa se recubre directamente con la muestra y se incuba con un anticuerpo conjugado a una enzima. La incubación es seguida por un lavado, que elimina los anticuerpos no unidos del medio. Luego se agrega el sustrato apropiado al medio, produciendo una señal directamente proporcional a la cantidad de antígeno en la muestra. Esta correlación se puede usar para extrapolar la concentración de antígeno en una muestra desconocida a partir de una curva de calibración. El aparato de medición a utilizar, generalmente un espectrofotómetro o un fluorómetro, dependerá de la enzima conjugada al anticuerpo. El ELISA directo es adecuado para determinar la cantidad de antígenos de alto peso molecular y se considera el tipo de ELISA más simple. Se requieren menos pasos y es considerablemente más rápido que otros tipos de ELISA. Otra ventaja es que se elimina la posibilidad de reactividad cruzada del anticuerpo secundario, que puede ocurrir en un ELISA indirecto. Sin embargo, el marcaje directo de los anticuerpos primarios requiere mucho tiempo, es costoso y puede afectar negativamente a la inmunorreactividad del anticuerpo con el antígeno al que está dirigido.
Figura 3. Esquema simplificado de un ensayo ELISA directo.
ELISA indirecto:
El ELISA indirecto es un proceso de unión de dos pasos que implica el uso de un anticuerpo primario y un anticuerpo secundario marcado. En este método, el anticuerpo primario se incuba con los pocillos de una placa recubiertos con antígeno. A continuación, se agrega un anticuerpo secundario marcado que reconoce el anticuerpo primario. Luego se agrega un sustrato para producir una amplificación de la señal. Este método se utiliza comúnmente para diagnosticar infecciones por bacterias, virus o parásitos y cuantificar los anticuerpos contra este antígeno extraño. La detección por ELISA indirecta es versátil, ya que se pueden usar diferentes marcadores de visualización con el mismo anticuerpo primario. Dado que se puede unir más de un anticuerpo marcado por objetivo de anticuerpo, se considera que el ELISA indirecto es altamente sensible y más flexible que el ELISA directo. Sin embargo, puede producirse reactividad cruzada y una señal no específica con el anticuerpo secundario.
Figura 4. Esquema simplificado de un ensayo ELISA indirecto.
ELISA Sándwich:
Los ensayos conocidos como ELISA sándwich utilizan dos anticuerpos específicos contra el antígeno para capturarlo a manera de emparedado (sándwich) en la placa de detección. En una primera la primera etapa, el antígeno de interés se añade a un anticuerpo primario unido a una placa. Durante una segunda incubación, se añade un anticuerpo secundario al complejo antígeno anticuerpo primario formado en el primer paso. El anticuerpo secundario puede estar directamente conjugado a una enzima que sólo requiera la adición del sustrato o estar unido a un marcador que requiera la adición de un segundo compuesto que es el que reaccionará directamente con el sustrato. Cuando se agrega un sustrato cromogénico al ensayo para desarrollar color, las muestras con una alta concentración de antígeno generan más señal que aquellas con una baja concentración de antígeno, lo que produce una señal directamente proporcional a la cantidad de antígeno en la muestra. Para estimar la concentración de antígeno presente en la muestra se extrapolan las mediciones con una curva de calibración. Este tipo de ensayo se usa generalmente para proteínas de peso molecular bajo a alto, como la endotelina 1 (por ejemplo, Endothelin-1 ELISA kit), HSP70 (AMP’D HSP70 high sensitivity ELISA kit), o la proteína de supervivencia de las neuronas motoras (SMN ELISA kit). Los ELISA sándwich son altamente específicos ya que se basan en un par de anticuerpos para la captura y detección en lugar de fijar de manera directa el antígeno a una placa de plástico, como se hace en el ELISA directo. Esto permite concentrar el antígeno de interés sobre la superficie de la placa aun cuando esté presente en concentraciones muy bajas en la mezcla inicial.
Figura 5. Esquema simplificado de un ensayo ELISA sándwich.
ELISA competitivo
En este tipo de análisis, la presencia y la cantidad de un antígeno particular en una muestra desconocida se determinan por su capacidad para competir con un antígeno de referencia marcado para unión a un anticuerpo fijo en una placa (Murphy, Travers y Walport, 2008). Primero, una cantidad determinada de anticuerpo no marcado se fija a un grupo de placas y una preparación de estándar de referencia de un antígeno marcado se une a ellas. A continuación se añaden diversas cantidades de muestra no marcadas y se mide el desplazamiento del antígeno marcado, lo que genera curvas de inhibición características. Se obtiene una curva estándar al usar cantidades conocidas de antígeno no marcado idénticas a las usadas en la especie marcada y una comparación con esta curva permite calcular la cantidad de antígeno en muestras desconocidas. Durante la incubación, las muestras con alto contenido de antígeno dan como resultado que el antígeno no marcado se une en mayores cantidades que el antígeno conjugado; por lo tanto, cuando se agrega un sustrato cromogénico al ensayo para desarrollar color, las muestras con una alta concentración de antígeno generan una señal más baja que las que contienen una baja concentración de antígeno, lo que produce una correlación inversa entre la concentración de antígeno en la muestra y el desarrollo de color en el ensayo. Este tipo de reacción es uno de los pocos métodos posibles para estimar la cantidad de antígenos de bajo peso molecular con un número limitado de epítopes o sitios de unión a anticuerpos, como moléculas pequeñas (por ejemplo, Direct cAMP ELISA kit), péptidos (por ejemplo, Oxytocin ELISA kit) y esteroides (Corticosterone ELISA kit).
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Ivan Leon
Representante de Allscience
Referencias Bibliográficas
- Aydin S. 2015. A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratoryexperience with peptide/protein analyses using ELISA. Peptides. 72: 4 15.
- Coons AH, Creech HJ, Jones RN. 1941. Immunological properties of an anti-body containing of fluorescent group. Pros Soc Exp Biol Med. 47:200–2.
- Engvall E, Perlmann P. 1971. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quanti-tative assay of immunoglobulin G. Immunochemistry. 8:871–874.
- Lequin R. 2005. Enzyme Immunoassay (EIA)/Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Clinical Chemistry. 51 (12): 2415–2418.
- Murphy K, Travers P y Walport M. 2008. Inmunobiología de Janeway. Séptima Edición. McGraw Hill Interamericana Editores. México, D.F., México.
- Van Weemen BK, Schuurs AH. 1971. Immunoassay using antigen-enzyme conjugates. FEBS Lett. 15:232–236.