新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒
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医疗检测用品
- 中文名
- 新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸检测试剂盒
- 外文名
- NewCoronavirus (2019-nCoV) Nucleic Acid Detection Kit
- 管理类别
- Ⅲ类医疗器械
2019-nCoV-PCR-反应液、2019-nCoV-PCR-酶混合液、2019-nCoV-PCR-阳性对照、2019-nCoV-PCR-阴性对照。
1．RNA恒温扩增-金探针层析法
采集咽拭子标本，对标本中的脱落细胞进行裂解，裂解释放出的病原体RNA在逆转录酶和T7 RNA聚合酶的作用下，经过逆转录和转录过程，实现病毒RNA的T7核酸扩增。扩增产物加入30ul新型冠状病毒检查液中，与特异探针杂交，最后，将混合液全部滴加至检测卡样孔内，通过层析显色读取结果。
2. 实时荧光PCR
实时荧光PCR是一种快速简便、成本较低、且已在临床广泛使用的感染性病原体核酸检测技术。新型冠状病毒2019-nCov属RNA病毒，PCR扩增前需要先进行逆转录反应(RT)，商品化试剂盒通常把RT反应液与PCR反应液预混在一起，一次性完成逆转录和扩增检测的全部过程，操作简便且明显降低逆转录后开盖易导致污染的风险。（以下介绍核酸检测以荧光PCR法为主进行相关阐述）
所有生物除朊病毒外都含有核酸，核酸包括脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），新型冠状病毒是一种仅含有RNA的病毒，病毒中特异性RNA序列是区分该病毒与其它病原体的标志物。新型冠状病毒出现后，针对新型冠状病毒进行全基因组序列的解析，并通过与其它物种的基因组序列对比，发现了新型冠状病毒中的特异核酸序列。临床实验室检测过程中，如果能在患者样本中检测到新型冠状病毒的特异核酸序列，那么就可以认为样本中存在病毒(已经感染)，应提示该患者可能被新型冠状病毒感染。反之表明样本中没有病毒(未感染)。
因为新型冠状病毒的高传染性，目前临床上都会对样本先灭活再检测，并且灭活方式多样，可以依据产品的情况采用加热的方式进行灭活，也可以直接放入带有灭活成份保存液中。
- 1.样本采集
根据试剂盒说明书“样本要求”部分进行样本采集，常规的样本类型包括(口)咽拭子、鼻(咽)拭子、痰液、支气管灌洗液、肺泡灌洗液或其他呼吸道分泌物等样本。由于新型冠状病毒为RNA病毒，RNA易降解，因此采集样本时应使用无RNA酶的拭子和无RNA酶的储存管。
2. 样本保存、转运
获得患者样本后，需尽快进行检测。如无法立即检测需要转运，应按照说明书对样本进行低温封装，并尽快送到专门的检测机构进行检测。
- 1.样本核酸的提取
检测机构收到样本后，对样本进行核酸提取，核酸提取试剂应使用批准产品说明书中指定的核酸提取试剂盒。
4. 样本检测
目前批准的产品均基于新型冠状病毒基因组中开放读码框1a/b(Open Reading Frame 1ab，ORF1ab)、包膜蛋白(Envelope Protein，E)和核衣壳蛋白(Nucleocapsid Protein，N)进行选择。不同产品的检测原理基本一致，但是其引物、探针设计存在不同，有单靶区段(ORF1ab)、双靶区段(ORF1ab、N蛋白)、三靶区段(ORF1ab、N蛋白和E蛋白)的检测和判读差别。建议使用者应严格按照不同企业说明书规定的判读方式进行判读。
1. 呼吸道标本或血液标本实时荧光RT-PCR检测新型冠状病毒核酸为阳性。
2. 呼吸道标本或血液标本病毒基因测序，与已知的新型冠状病毒高度同源。
实验室要确认某病例为阳性，须满足以下条件：同一份标本中新型冠状病毒至少2个靶标(ORF1ab/N/E)、实时荧光RT-PCR检测结果均为阳性。
如一个靶标阳性或检测结果落在灰区的标本需复测，且尽可能用另一种试剂复验，仍然可疑则须重新采样(包括不同部位及样本类型)进行检测。
阴性结果也不能完全排除新型冠状病毒感染，需要排除可能产生假阴性的因素，包括：样本质量不合格，样本收集得过早或过晚，没有正确地保存、运输和处理样本，方法学窗口期，技术本身存在的原因如病毒变异、PCR抑制等。
核酸检测报告必须规范，要以临床医师能够正确理解和应用的方式报告结果，至少涉及以下要素。
1. 报告要及时，需向临床明确检测周转时间(Turn-Around Time, TAT)。
2. 报告内容须完整，包括患者信息，标本信息(种类、唯一编号及其质量)，检测信息(靶点、方法、试剂/仪器)，采样、接收、检测和报告时间，送检单位/检测实验室及联系方式等。
3. 报告上明确标出“检出限”(不可混用为参考值/参考区间；应根据试剂盒说明书及性能验证结果来确定；不同试剂盒会存在差异)。
4. 报告方式：不报告为“阴性”、“阳性”。
(1)阴性结果报告为“未检出”或“低于检出限”，同时应备注“未检出”的可能原因：方法学局限性，标本采集时机，标本采集/运输/储存/检测等环节的问题等。
(2)阳性结果报告为“检出”并标出具体靶标。
(3)“可疑结果”描述为：1个靶点阳性，或检测结果低于检出限但有扩增反应(在灰区)，已复验，建议重新采样检测。
5. 必要时，结合实验室其他指标尤其是血清学免疫指标(如有)进行综合分析，给出相应的解释或建议 [1]。
1. 核酸检测的整个检测流程操作复杂，不同产品因存在不同反应体系及适用机型等因素，操作过程中试验人员应按照各自产品说明书要求进行。保证样本的检测准确，应从患者样本的采集开始进行质量控制，并对后续各个流程规范操作(如样本的保存、转运等)。
2. 新型冠状病毒传播能力强，危险系数高，个人防护应为生物安全三级实验室级别。每个操作人员必须具备专业技能且拥有PCR检验资质。整个操作过程中需防范气溶胶污染对人员的感染风险，并做到准确加样和正确使用试剂和耗材。
3. 为防止病毒扩散，检测新型冠状病毒的实验室必须达到生物安全二级(P2)及以上实验室条件，实验室管理应严格按照PCR基因扩增实验室的管理规范，实验操作必须严格分区，各区域使用的仪器、设备、耗材和工作服必须专用，不得交叉使用，避免污染。
